摘要：目的氮素是中药材有效成分积累的重要影响元素，为探讨不同氮源对丹参Salviamiltiorrhiza和藏丹参Salviacastanea毛状根生长和活性成分积累的影响。方法分别采用硝酸铵、水解乳蛋白、蛋白胨、牛肉浸膏、酪蛋白和酵母提取物6种氮源处理对丹参和藏丹参毛状根的影响，分析毛状根生长及活性成分积累的变化。结果硝酸铵最有利于2种丹参毛状根的生长。水解乳蛋白能够显著促进丹酚酸类成分的积累，与硝酸铵对照相比，丹参迷迭香酸和丹酚酸B含量分别提高了2.94倍和3.27倍，藏丹参二者含量分别提高了13.74倍和2.01倍。酵母提取物对2种丹参毛状根二氢丹参酮Ι和隐丹参酮积累的促进效果最为显著，水解乳蛋白能显著促进丹参根中丹参酮IIA的积累，牛肉浸膏则对藏丹参中丹参酮IIA积累的促进作用最为显著。结论硝酸铵是2种丹参毛状根生长的最佳氮源，水解乳蛋白是丹酚酸积累的最佳氮源，不同氮源对4种丹参酮的影响不一致，丹参和藏丹参对不同氮源的响应也不一致。该研究不仅对丹参毛状根规模化培养及活性成分工业化生产具有一定指导意义，也对藏丹参资源的开发利用提供了借鉴作用。
丹参SalviamiltiorrhizaBunge又名赤参，多用于治疗心脑血管，肝脾肿大等疾病[1]。丹酚酸B等酚酸类物质对干硬脉化等慢性肝病具有很好的防治作用[2]。丹参酮IIA等丹参酮类物质具有较强的清除自由基能力[3]，隐丹参酮可以抑制癌细胞增殖，具有抗肿瘤作用[4]，二氢丹参酮诱导jurkat细胞凋亡，引起分裂周期阻滞的效果较为显著[5]。
藏丹参SalviacastaneaDielsf.tomentosaStib，原名绒毛鼠尾草，又称“林芝丹参”，是栗色鼠尾草SalviacastaneaDiels的绒毛变型，主要分布于西藏林芝地区。藏丹参根与丹参根有效成分相近，在当地长期作为丹参的替代品用于治疗疾病[6-7]。年获得西藏自治区食品药品监督管理局批准作为地方药材标准，并正式改名为“藏丹参”[8-9]。藏丹参根中脂溶性成分含量显著高于丹参，其中丹参酮IIA和隐丹参酮最高分别达到丹参的6倍和10倍以上，其水溶性成分迷迭香酸含量也较高，但丹酚酸B含量较低[10]。可见藏丹参作为丹参酮和迷迭香酸的药源具有重要意义。
毛状根是根类药用植物研究的重要材料[11]，丹参毛状根培养体系的优化已有大量文献报道。培养基组成对丹参毛状根生长和活性成分积累具有重要影响[12]。毛莹等[13]研究发现，6,7-V培养基中缺少大量元素时，能够显著促进丹参酮类成分的积累。氮素是影响植物生长和次生代谢产物积累的重要因素[14]。蛋白胨能够显著提高虫草素的积累[15]；酵母提取物有利于促进黄芩悬浮细胞鲜干质量的增长[16]；mg/L水解乳蛋白促进红栌丛生芽增殖的效果显著[17]；适量的氮素有利于促进玉米叶片内可溶性蛋白和脯氨酸的积累[18]，但不同氮源对丹参毛状根生长和活性成分积累的影响的系统比较尚未有文献报道。藏丹参虽然具有高丹参酮和迷迭香酸积累的特点，但其根的生物量较低，藏丹参毛状根的生长也较为缓慢，因此研究不同氮源对藏丹参毛状根和活性成分积累的影响对于藏丹参资源的开发利用也具有重要意义。
本研究拟通过比较不同氮源对丹参和藏丹参毛状根的生长及活性成分含量和产量的影响，以期获得2种毛状根生长和活性成分积累的最佳氮源，不仅可以为丹参毛状根的规模化培养和有效成分的工业化生产提供理论依据，也可以帮助科研人员进一步理解藏丹参高丹参酮和迷迭香酸积累的特性，为藏丹参资源开发利用奠定基础。
1材料与仪器
1.1材料
所用样品由陕西天士力公司提供，由浙江理工大学祁哲晨副教授鉴定为丹参SalviamiltiorrhizaBunge和藏丹参SalviacastaneaDielsf.tomentosaStib的种子。所用丹参、藏丹参毛状根由发根农杆菌ATCC分别侵染丹参、藏丹参无菌苗获得。
1.2试剂
对照品咖啡酸（MUST-）、迷迭香酸（MUST-）、丹酚酸B（MUST-）、二氢丹参酮（MUST-）、隐丹参酮（MUST-）、丹参酮I（）、丹参酮IIA（MUST-）均购自中国食品药品检定研究院，质量分数均大于98%；色谱级甲醇、乙腈（德国默克公司）、硝酸铵、水解乳蛋白、蛋白胨、牛肉浸膏、酪蛋白、酵母提取物、胰蛋白胨均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.3仪器
Waterse型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters二极管阵列检测器、Empower3色谱分析仪（美国Waters公司）；DenverTP-型电子天平（北京赛多利科学仪器有限公司）；KQ-DE型超声洗涤器（昆山市超声仪器有限公司）；纯水仪（康雷仪器有限公司）；超净工作台（博迅医疗设备厂）、微型粉碎机（杭州奥盛仪器有限公司）。
2方法
2.1诱导毛状根
以硝酸铵（对照组）、水解乳蛋白、蛋白胨、牛肉浸膏、酪蛋白和酵母提取物为氮源。在超净工作台内精密称量丹参毛状根0.2g，藏丹参毛状根0.3g（藏丹参生长缓慢），转接到含有不同氮源6,7-V培养基的mL锥形瓶中，置于温度为25℃，转速r/min摇床中避光生长24d，每组实验均设4个生物学重复。
连续生长24d后，用无菌水清洗2种丹参毛状根表面培养液，擦干水渍，称其鲜质量。置于50℃恒温烘箱中烘干至恒定质量，称其干质量。
2.2有效成分的测定
2.2.1色谱条件测定咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、和丹参酮IIA含量。采用Waterse二元高效液相色谱Waters紫外光检测器，WaterssunfireC18色谱柱，柱温30℃，上样体积20μL，体积流量1mL/min，样品运行96min。丹参酮类成分色谱检测波长为nm，丹酚酸类成分色谱检测波长为nm。流动相为0.02%磷酸水（A）和色谱级乙腈（B），梯度洗脱，0～10min，95%～80%A；10～28min，80%～70%A；28～45min，70%～55%A；45～85min，55%～5%A；85～96min，5%～95%A。对照品色谱图及丹参毛状根供试样品色谱图见图1。
2.2.2对照品溶液的制备精密称取对照品咖啡酸2.52mg、迷迭香酸3.28mg、丹酚酸B0.95mg，置于10mL离心管中用等体积50%色谱级甲醇溶解，超声45min混匀，即得质量浓度均为1mg/mL的酚酸类成分对照品溶液。精密称取对照品二氢丹参酮I1.23mg、隐丹参酮2.55mg、丹参酮I0.72mg、丹参酮IIA1.01mg，置10mL离心管中用%的色谱级乙腈溶解、超声45min混匀，即得质量浓度均为1mg/mL的丹参酮类成分对照品溶液。
2.2.3供试品溶液的制备将烘干的2种毛状根转移至装有小钢珠的5mL离心管中，借助微型粉碎机将干燥毛状根粉碎，精密称取0.05g，转移至另一5mL离心管中，加入2.5mL70%甲醇提取液，超声提取45min后，10r/min离心10min，上清液经0.22μm的微孔滤膜注入上样小瓶，备用。
2.2.4精密度试验本研究方法学主要参考郑丽玲等[19]的研究方法，取丹参样品，按照“2.2.3”项下方法制备供试样品溶液，连续进样6次，记录色谱图。结果表明，各主要色谱峰的保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3.0%，符合特征图谱要求，仪器精密度良好。
2.2.5重复性试验取丹参样品6份，按照“2.2.3”项下方法制备供试样品溶液，检测色谱图中各个主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3.0%，符合特征图谱要求，表明方法重复性良好。
2.2.6稳定性试验取丹参样品6分，按照2.2.3项下方法制备供试样品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h检测色谱图，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于5.0%，符合特征图谱要求，表明供试样品溶液在24h内稳定。
2.2.7加样回收率试验精密称取已测定的丹参样品6份，分别加入低、中、高3个质量浓度的混合对照品，按照“2.2.3”项下方法制备供试样品溶液，计算各对照品成分的回收率，结果表明，7种有效成分的加样回收率变化范围为85.1%～96.08%，RSD值小于2%，表明在提取和分析过程中系统误差较小。
3结果与分析
3.1不同氮源对丹参和藏丹参毛状根生长的影响
分析了6种氮源对2种丹参和藏丹参毛状根生长的影响，结果如图1所示，对照组的2种毛状根生长状态较好，鲜质量和干质量均为最高，丹参毛状根鲜、干质量分别达到1.g和0.g，藏丹参毛状根鲜、干质量分别为2.g和0.g（藏丹参最初加入量为0.3g）；以酪蛋白为氮源的培养基中，丹参毛状根生长状态最差，鲜、干质量均为最低，鲜质量只有0.g，干质量仅有0.g，与对照组相比分别降低了87%和73.51%，可见酪蛋白严重抑制了丹参毛状根的生长；以酵母提取物为氮源的藏丹参毛状根生长状态较差，鲜干质量均为最低，鲜质量只有0.g，干质量仅有0.g，与对照组相比分别降低了80.8%和64.71%，酵母提取物显著抑制了藏丹参毛状根的生长。
3.2不同氮源对丹参和藏丹参毛状根酚酸类成分积累的影响
为了研究6种氮源对2种丹参毛状根酚酸类成分积累的影响，检测分析了毛状根中咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B等3种成分的质量分数和产量。结果如图2、3所示，水解乳蛋白能够有效促进2种丹参毛状根中酚酸类活性成分的积累，酚酸类有效成分含量和产量均为最高。水解乳蛋白对丹参迷迭香酸和丹酚酸积累B的促进效果较为显著，迷迭香酸的质量分数和产量为2.mg/g和4.mg/L，分别是对照组的3.94倍和2.倍；丹酚酸B的质量分数和产量分别为6.mg/g和10.mg/L，分别是对照组的3.27倍和1.94倍；水解乳蛋白对咖啡酸积累的影响不显著。6种氮源中，酪蛋白最不利于迷迭香酸和丹酚酸B的积累，迷迭香酸的质量分数和产量分别为0.mg/g和0.mg/L，与对照组相比含量和产量分别降低了79.03%和94.43%；丹酚酸B的质量分数和产量仅为0.mg/g和0.mg/L，与对照组相比其质量分数和产量分别降低了87.3%和96.61%。
与丹参一致，水解乳蛋白对藏丹参毛状根酚酸类成分积累的促进效果最为显著。其中迷迭香酸质量分数和产量分别达到16.mg/g和32.mg/L，与硝酸铵对照组相比分别提高了13.74倍和7.51倍；丹酚酸B的质量分数和产量分别达到1.mg/g和3.mg/L，是对照组的2.01倍和1.70倍。以酵母提取物为氮源虽然能提高咖啡酸的含量，但却显著抑制了丹酚酸B的积累，6种氮源处理中，酵母提取物处理丹酚酸B积累最低，其质量分数和产量仅为0.mg/g和0.mg/L与对照相比分别降低了69.34%和89.13%。可见酵母提取物对不同的酚酸类活性成分的作用效果不同。与丹参不同的是，酪蛋白和蛋白胨均不同程度地提高了迷迭香酸和丹酚酸B的含量。
3.3不同氮源对丹参和藏丹参毛状根丹参酮类成分积累的影响
为了探讨6种氮源对2种丹参毛状根丹参酮类成分积累的影响，检测分析了毛状根中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的含量与产量。结果如图4、5所示，5种氮源均能够不同程度促进丹参毛状根中丹参酮类成分积累。酵母提取物氮源能够显著促进丹参毛状根二氢丹参酮I和隐丹参酮的积累，二氢丹参酮I的含量和产量分别为5.mg/g和8.mg/L，与对照组相比分别提高了67.96倍和36.47倍；隐丹参酮的含量和产量次之，分别为4.mg/g和6.mg/L，是对照组的53.58倍和29.25倍。水解乳蛋白能有效促进丹参酮I和丹参酮IIA的积累，其含量分别为0.mg/g（对照组的6.65倍）和0.mg/g（对照组的6.05倍），其产量分别为1.mg/L（对照组的3.倍）和0.mg/L（对照组的3.倍）。
与丹参一致，酵母提取物能够显著促进藏丹参毛状根中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I的积累，其中隐丹参酮的促进效果最显著，含量和产量均达最高，为11.mg/g和14.mg/L，分别是对照组的.68倍和.62倍；二氢丹参酮I的含量和产量次之，分别为6.mg/g和7.mg/L，是对照组的.5倍和.65倍。不同的是牛肉浸膏促进藏丹参中丹参酮IIA积累的作用最为显著，其含量和产量分别3.mg/g和2.mg/L，是对照组的6.76倍和2.69倍。可见，酵母提取物和牛肉浸膏2种氮源对藏丹参4种丹参酮类活性成分的促进效果明显不同。
4讨论
氮素是植物生长和次生代谢积累的重要影响因素，在植物养分吸收及经济效益方面发挥着重要的作用[19-20]。硝酸铵是一种重要的氮源已被广泛用作激发剂以刺激植物生长和发育，可以在受控条件下诱导次级代谢产物[21]，能够显著提高叶绿素的合成，促进营养物质的积累[22]；金铁锁毛状根悬浮培养的研究发现，当培养基中NH4+与NO3?的浓度比为1∶2时，金铁锁毛状根的生物量最佳[23]；增氮处理能够增加氮代谢的活性，提高光合作用中光反应和暗反应速率，施氮处理促进紫花苜蓿高、丹草等植物的生物量积累效果显著，促进作物对氮素的吸收利用，可以显著提高作物产量[24-26]。周伟等[27]认为无机氨比有机氨（水解乳蛋白、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏）更有利于丹参毛状根的生长。本研究发现，以硝酸铵为氮源的培养基，毛状根生长状态较好，生物量积累最高，鲜、干质量与其他5种氮源培养基差异显著，这与硝态氮和铵态氮对于毛状根的生长均有促进作用有关[28]，与本研究结果一致。
李博华等[29]研究表明，1.0g/L的水解酪蛋白或水解乳蛋白对四倍体菘蓝毛状根生长具有促进作用（分枝多、产量高）。但本课题组发现，水解乳蛋白抑制了丹参和藏丹参毛状根的生长，这与前人研究结果存在差异，可能是由于毛状根的材料不同，水解酪蛋白或水解乳蛋白的浓度不同以及培养基的种类不同造成的。水解乳蛋白氮源虽然不利于丹参毛状根的生长，但在促进丹参毛状根水溶性活性成分积累方面效果最佳，且对4种脂溶性丹参酮类物质的含量均有不同程度的提高。水解乳蛋白对2种毛状根酚酸类成分积累均有显著促进作用，丹参迷迭香酸的含量和产量分别提高了2.94倍和1.倍，藏丹参迷迭香酸含量和产量分别提高了13.74倍和7.51倍，可见2种丹参毛状根对水解乳蛋白的响应存在差异。蛋白胨、酪蛋白抑制了丹参毛状根迷迭香酸和丹酚酸B的积累，促进了藏丹参毛状根迷迭香和丹酚酸B的积累，但2种丹参毛状根脂溶性丹参酮类物质的含量均有不同程度的提高。综合来看，酵母提取物氮源的作用效果最佳。
与硝酸铵相比，酵母提取物对丹酚酸类成分积累的影响并不明显，但却能显著促进丹参酮类成分的积累。研究发现，在基础培养基中添加酵母粉，可以显著提高灵芝中萜类化合物含量[30]；酵母提取物能够显著上调丹参酮合成途径中相关基因的转录本，提高异戊二烯磷酸异构酶和香叶基香叶基二磷酸合成酶的表达，调控藏丹参毛状根中丹参酮次生代谢相关基因的效果显著，促进藏丹参毛状根中丹参酮积累作用显著[31]。Kai等[32]研究发现酵母提取物能够不同程度提高丹参酮生物合成途径中SmAACT、SmHMGS、SmDXR、SmDXS2等关键酶的活性显著促进了隐丹参酮和丹参酮IIA的积累。研究表明酵母提取物能够激活丹参毛状根中Ga2+/钙调蛋白信号传导途径，免疫蛋白表达增加，促进丹参酮，丹酚酸等代谢产物积累[33]。本研究发现酵母提取物对2种丹参毛状根丹参酮类成分积累也具有显著的促进作用，这与前人研究结果一致。但两种毛状根中丹参酮类物质的促进效果存在差异，丹参毛状根中二氢丹参酮I含量和产量分别是硝酸铵对照组的68.96倍和37.74倍；隐丹参酮的含量和产量分别是对照组的53.58倍和29.25倍；藏丹参毛状根中二氢丹参酮I的含量和产量分别是对照组的.5倍和.65倍，隐丹参酮含量和产量分别为对照组的.68倍和.62倍，可见藏丹参对酵母提取物的响应较丹参效果显著。野生藏丹参脂溶性有效成分虽含量较高，但其生长缓慢，产量很低，通过优化2种丹参毛状根的培养条件，发现两种丹参脂溶性成分的积累对酵母提取物均有较好的响应，含量和产量均能显著提高，该研究对丹参毛状根规模化培养及丹参酮和丹酚酸工业化生产具有一定指导意义，同时为藏丹参的规模化培养和进一步开发利用藏丹参资源提供了思路和理论指导。前期的研究推测由丹参酮二烯衍生出2条合成途径分别形成不同的二萜类化合物[34]。研究发现，6种氮源对丹参毛状根二氢丹参酮I与隐丹参酮，丹参酮I与丹参酮IIA的促进效果相似，这可能是由于二氢丹参酮I、隐丹参酮和丹参酮I、丹参酮IIA处在合成途径不同的分支上。本研究与前人研究结果一致，而藏丹参中除丹参酮IIA外二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I3种丹参酮类物质对6种氮源均表现出相同的响应效果。酵母提取物对藏丹参丹参酮IIA积累的作用不显著，但牛肉浸膏却能显著促进藏丹参丹参酮IIA的积累，但这一机制并不清楚。
5结论
本研究发现无论是丹参还是藏丹参，硝酸铵最有利于毛状根的生长。水解乳蛋白对2种丹参毛状根酚酸类成分的积累均具有显著促进作用；蛋白胨、牛肉浸膏、酪蛋白和酵母提取物抑制了丹参迷迭香酸和丹酚酸B的积累。与丹参不同，只有牛肉浸膏和酵母提取物抑制了藏丹参酚酸类成分的积累。水解乳蛋白、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物对丹参毛状根丹参酮类成分积累均有显著促进作用，其中酵母提取物的促进效果最为显著，酪蛋白对丹参毛状根丹参酮I、丹参酮IIA产量作用效果不显著，但却显著提高了二者的含量。与丹参不同，牛肉浸膏对藏丹参毛状根丹参酮IIA的促进效果最为显著，酵母提取物对藏丹参毛状根中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I积累的促进效果显著。
毛状根是研究根类药材的重要材料，在规模化生产方面具有重要前景，然而目前丹参毛状根有效成分含量和产量依然较低。氮素是植物次生代谢产物积累的重要影响因素，合适的氮源及适量的氮素对植物活性成分积累有显著的促进作用。本研究结果不仅为丹参毛状根的规模化培养和活性成分的工业化生产提供了理论依据，也对藏丹参资源的开发利用提供了借鉴。
参考文献（略）
来源：王飞艳，尤华乾，杜旭红，杨宗岐，张晓丹，梁宗锁，杨东风.不同氮源对丹参和藏丹参毛状根有效成分积累的影响[J].中草药,,51(9):-.
